Трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота

1.1. Введение

1.1.1. Трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота является новым биотехнологическим приемом в селекции, основной эффект которого в увеличении количества потомков по материнской линии. Метод трансплантации эмбрионов включает следующие приемы: вызывание полиовуляции у доноров, извлечение эмбрионов, их сохранение и пересадка реципиентам.

1.1.2. Основным назначением метода на данном этапе является получение быков-производителей и маток воспроизводящих групп, а также сохранение генофонда.

1.1.3. Непременными условиями для проведения работ по трансплантации являются полноценное кормление и содержание животных, хорошая организация воспроизводства стада, а также наличие квалифицированных специалистов.

На современном этапе развития метода трансплантации эмбрионы крупного рогатого скота можно получать как от коров постоянного донорского стада, так и от разовых доноров, извлекая эмбрионы не ранее 60 дней после отела, без вывода животных из основного стада, непосредственно в племзаводах.

1.2. Отбор животных в доноры эмбрионов

1.2.1. Отбор животных в доноры проводит комиссия, в которую должны входить специалисты ветеринарной и племенной службы и специалисты по трансплантации эмбрионов.

1.2.2. Генетическое превосходство животного определяется ценностью его предков, длительностью хозяйственного использования, собственной продуктивностью и продуктивностью его потомства, а также соответствием стандарту (по типу) породы. При подборе коров-доноров для использования в целях сохранения генофонда локальных пород руководствуются задачами сохранения всего генетического разнообразия.

1.2.3. Донорами эмбрионов могут быть коровы со следующими признаками:

– клинически здоровые, без признаков нарушения обмена веществ (ожирение, дистрофия и т.д.) и реагирующие полиовуляцией при гормональной обработке;

– с межотельным периодом в предыдущих лакгациях 360-380 дней;

– с сервис-периодом 70-90 дней;

– проявлением первой охоты до 50 дней после отела;

– легкостью отела и не осложненным течением послеродового периода;

– индексом осеменения 1,2-1,5;

– нормальным состоянием матки и яичников.

1.2.4. Отбор доноров по селекционным признакам.

Для получения ценного племенного материала необходимо матерей-доноров будущих производителей отбирать в стадах ведущих племенных хозяйств.

1.2.5. Отбор коров в доноры по состоянию половой системы и прогнозирование полиовуляции.

Из числа доноров сразу исключают коров с узким анусом, наличием эндометрита к 35 дню после отела, фолликулярными кистами, а также животных, имеющих незавершенную инволюцию матки к этому же сроку.

Отбирают животных с нормальным течением послеродового периода, у которых на протяжении 60 дней после отела зарегистрированы две овуляции и хотя бы одна выраженная охота. Коров, стабильно дающих качественные эмбрионы, ставят на особый учет для ежегодного использования в качестве доноров. При хорошей эмбриопродуктивности и выдающихся селекционных признаках коровы-донора можно планировать двух-трехразовое получение эмбриона.

1.2.6. Требования к коровам-донорам быковоспроизводящей группы:

– высокая молочная продуктивность с учетом средней продуктивности за все лактации с выходом молочного жира и белка;

– наличие данных о происхождении не менее, чем по трем рядам предков, принадлежащих к высокопродуктивному семейству, перспективной линии (желательно, чтобы отец коровы-донора имел племенные категории А, Б);

– крепкая конституция и экстерьер с оценкой не ниже 8 баллов;

– чашеобразная или ваннообразная форма вымени;

– интенсивность молокоотдачи – 1,8-2,0 кг/мин;

– живая масса – нениже стандарта породы;

– возраст (наиболее желательный) – от 3 до 6 отелов;

– достоверность происхождения по группам крови.

1.3. Комплектование донорского стада.

1.3.3. Комплектование донорских стад осуществляют только из хозяйств, благополучных по заразным болезням животных, что должно быть подтверждено ветеринарным свидетельством или сертификатом.

На каждое животное оформляется ветеринарное свидетельство (форма №1) с указанием клинического состояния здоровья, благополучия по бруцеллезу, туберкулезу, вирусным респираторным заболеваниям, лейкозу, трихомонозу, вибриозу, инфекционному ящуру.

1.3.2. Учитывая индивидуальные особенности животных по реакции полиовуляции, первоначально количество коров должно превышать потребность в донорах в 2-3 раза. Выявление коров-доноров проводится непосредственно в хозяйствах (на фермах) с использованием пробной гормональной обработки и извлечения эмбрионов. Окончательный отбор проводят после установления реакции коров на введение гонадотропных гормонов для вызывания полиовуляции. При отсутствии реакции на гормональную обработку корову в доноры не переводят.

Коров, прошедших разовую гормональную обработку и давших биологически полноценные эмбрионы за первую операцию, переводят в группу коров-доноров.

1.4. Подготовка коров в доноры эмбрионов.

Основнымтребованием отбора коров в доноры по физиологическому состоянию является отсутствие у них послеотельных осложнений. Поэтому наибольшее значение приобретают профилактика и раннее лечение послеотельных осложнений, которые необходимо осуществлять в сухостойный и послеродовой периоды.

1.4.1. Организация сухостойного периода коров, отобранных в доноры.

Нарушения процесса родов и послеродового периода часто связаны с причинами, возникающими задолго до отела. Поэтому необходимо начинать профилактику затрудненных отелов и послеотельных осложнений у доноров с сухостойного периода важнейшего в воспроизводительном процессе.

При составлении рационов для доноров руководствуются нормами и рационами кормления (“Нормы и рационы кормления сельскохозяйственных животных”, М., 1995).

Для профилактики послеотсльных осложнений коров обрабатывают эмульсией витамина А и антисептика стимулятора Дорогова фракция 2 (АСД-Ф2). Непосредственно перед применением препараты АСД-Ф2 и витамина А смешивают, тщательно взбалтывают до получения однородной эмульсии и вводят коровам за 30 дней до предполагаемого отела трехкратно внутримышечно с интервалом 5 дней. Однократная доза витамина А – 7-10 см” (500-800 тыс. ИЕ), АСД-Ф2 – 1,7-2.0 см’ (0,003-0,004 см3 на 1 кг массы животного) (“Наставление по применению витамина А и АСД-Ф2 для профилактики задержания последа у коров”, 1988г.).

Коров в сухостойный период необходимо зимой выпускать на прогулку в загоны или устраивать активный моцион до 2 км, а летом содержать на пастбище.

1.4.2. Организация содержания и кормления коров-доноров а послеродовой период и при получении эмбрионов.

Для предупреждения послеотельных осложнений, своевременного возобновления циклической активности яичников и восстановления матки на 2-3 день после отела проводят фармако-профилактику с внутриматочным введением антимикробных препаратов. Наиболее эффективным в этот период является применение антибиотиков широкого спектра действия в сочетании с йодистыми препаратами.

Профилактика предполагает систематическое наблюдение за животными. С 10 дня после отела состояние яичников и матки коровы определяют методом ректального исследования с интервалом 5-7 дней. Каждую неделю (до появления охоты) проводят витаминизацию – 1 млн. ИЕ витамина А. При первых признаках эндометрита необходимо сразу же начинать интенсивное лечение.

К 50 дню после отела половая система донора должна придти в норму. Животное должно проявить охоту с полноценной овуляцией и четкими внешними признаками.

Для получения наибольшей эмбриопродуктивности необходимо организовать индивидуальное нормированное кормление доноров с учетом изменения живой массы и молочной продуктивности, потребности в питательных веществах по месяцам лактации.

1.5. Обработка коров-доноров для получения эмбрионов.

1.5.1. Гормональная обработка коров для вызывания полиовуляции.

Гормональную обработку с целью индуцирования реакции полиовуляции начинают через 50-60 дней после отела. Перед этим контролируют состояние половой системы коровы с помощью ректогенитального обследования. Наличие выраженной охоты и хорошо сформированного желтого тела в одном из яичников на 8-14 день цикла являются показанием для начала гормональной обработки. В случае отсутствия признаков явной охоты или ее пропуске,но нормальном состоянии половой системы стимулируют охоту введением аналогов простагландина Р-2а.

Полиовуляцию вызывают введением гипофизарного препарата фолликулостимулирующего гормона ФСГ-супер.

Примерные схемы обработок для вызывания полиовуляции представлены в таблице 13.1.

Таблица 13.1

Примерные схемы обработок коров для вызывания полиовуляции

Дни цикла Время суток, час Схемы обработок
I II III
ФСГ, мг ПГF-2, мкг ФСГ, мг ПГF-2, мкг ФСГ, мг ПГF-2, мкг
9 8 5 5 7
20 5 5 7
10 8 4 5 6
20 4 5 6
11 8 3 500 5 500 5 500
20 3 5 5
12 8 2 5 4
20 2 5 4
13 8 3
выявление в охоте и осеменении
14 выявление в охоте и осеменении

ФСГ вводят на протяжении 4-5 дней, дважды в сутки в одинаковых или убывающих дозах с интервалом 12 часов.

Подготовкупрепарата ФСГ-супер проводят в соответствии с наставлением. Растворы препарата во время обработок (4-5 дней) хранят в холодильнике в соответствии с правилами асептики. Для более длительного периода хранения необходимо поместить раствор в морозильную камеру.

Часто отсутствие реакции полиовуляции может быть вызвано передозировкой гонадотропина. Поэтому лучше сначала применить суммарную дозу ФСГ 28-30 мг. Если корова не отреагировала, то дозу увеличивают на 50%, в самом крайнем случаена 100%. Доза препарата, превышающая 50 мг, не увеличивает количество овуляций и выход качественных эмбрионов.

Сочетанное применение гормональных средств с другими биологически активными веществами и стимуляция первого пула фолликулов повышают выход качественных эмбрионов (табл. 13.2).

Таблица 13.2

Схема обработки с предварительной стимуляцией фоллнкулогенеза

Дни цикла Время суток, час Введение препаратов
Витамин А, см3 АСД-ф2, см3 ФСГ, мг ПГF-2, мкг
0 5 2
3 8 2
20 2
5 5 2
9 8 6
20 6
10 8 5 2 5
20 5
11 8 3
20 3 500
12 8 2 500
20 2
13 выявление в охоте и осеменение
14 выявление в охоте и осеменение

Витамин А вводят с АСД-Ф2. Для этого непосредственно перед инъекцией оба препарата тщательно смешивают и полученную эмульсию вводят внутримышечно.

Повторную гормональную обработку коров проводят с учетом индивидуальных особенностей животных через 2-3 половых цикла после спонтанной охоты.

1.5.2. Осеменение доноров.

Охота у доноров с полиовуляцией обычно начинается через 36-48 часов после введения простагландинов. Коров при полиовуляции осеменяют 3 раза с 12-часовыми интервалами. Первое осеменение проводят спустя 8-12 часов после начала охоты. Метод осеменения – ректоцервикальный. Маноцервикальный метод осеменения доноров не допускается. Сперму вводят в теломаткиили в оба рога. Введение спермы в один из рогов матки при осеменении доноров недопустимо. Осеменение проводят двойной дозой семени (неменее 50 млн. подвижных сперматозоидов).

Если корова-донор не проявляет внешних признаков охоты при наличии зрелых фолликулови течки,ее осеменяют через 60 и 70 часов после инъекции простагяандинов.

1.6. Подготовка инструментов я приготовление сред.

1.6.1. Подготовка эмбрионального фильтра ФЭ-1. Перед работой чистый и сухой эмбриональный фильтр споласкивают 70° спиртом, затем дистиллированной водой и высушивают. Стерилизуют фильтр под ультрафиолетовой лампой в течение I часа на расстоянии не более 70 см.

По окончании работы фильтр споласкивают проточной водой, с помощью мыльного раствора мягкой кисточкой очищают поверхность сеток фильтра от налипшей слизи, затем фильтр 3-4раза споласкивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе.

1.6.2. Приготовление сред для извлечения и культивирования эмбрионов.

Приготовление растворов проводят в стерильных условиях, используя стерильную посуду, которую вскрывают непосредственно перед употреблением.

При работе с эмбрионами применяют модифицированный сбалансированный солевой раствор Дюльбекко (ФБС). Для пунктов трансплантации этот раствор должен поступать в готовом (растворенном) виде. Непосредственно перед работой по извлечению эмбрионов в раствор ФБС добавляют 2% фетальной сыворотки крови крупного рогатого скота.

Для кратковременного культивирования и приготовления криозащнтных сред используют раствор Дюльбекко с добавлением 15% фетальной сыворотки крупного рогатого скота или бычьего сывороточного альбумина из расчета 4 г/л среды. Все препараты должны быть стерильны.

Санацию сред для извлечения и культивирования проводят санирующими препаратами (канамицином, пенициллином, ГАМПом, полигеном и др.), не имеющими эмбриотоксического действия, согласно наставлению по их применению.

Перед использованием готовую среду для культивирования фильтруют через бактериальный мембранный фильтр (диаметр пор – 0,22 мкм).

1.6.3. Приготовление сред для замораживания эмбрионов.

Среду для замораживания эмбрионов готовят из реактивов высокой степени чистоты (ХЧ и ЧДА). Глицерин – основной компонент криозавдитной среды для замораживания эмбрионов.

Для стерилизации глицерин помещают во флакончиках в сушильный шкаф при температуре 100…110°С и выдерживают 20-30 минут. Затем плотно закупоривают стерильной пробкой и хранят до использования в темном месте.

Для замораживания эмбрионов готовят 1,5 М и 0,75 М растворы глицерина.

Для приготовления 1,5 М раствора глицерина к 9,5 см среды культивирования с санирующим препаратом добавляют 1,2 см глицерина. 0,75 М раствор глицерина получают разбавлением в два раза 1,5 М раствора глицерина средой культивирования.

1.6.4. Приготовление сред для оттаивания эмбрионов.

Среды для оттаивания можно приготовить заранее, разлить в стерильные флаконы и хранить в замороженном состоянии.

Схема приготовления основных сред для оттаивания:

– среда А – 15% раствор фетальной сыворотки или 0,4% раствор бычьего сывороточного альбумина на среде Дюльбекко с санирующим препаратом;

– среда Б – 10% раствор глицерина (10 см3 глицерина разбавляют до 100 см3 средой А);

– среда В – 1М раствор сахарозы (34,23 г сахарозы разбавляют до 100 см3 средой А).

Схема приготовления рабочих сред представлена в таблице 13.3.

Таблица 13.3

Приготовление сред для оттаивания эмбрионов

№ среды Среды (добавляемый объем в см3) Окончательный объем, см3 Состав полученной среды
А Б В
1 0,5 3,0 1,5 5,0 6% раствор глицерина с 0,3 М сахарозы
2 2,0 1,5 1,5 5,0 3% раствор глицерина с 0,3 М сахарина
3 3,5 1,5 5,0 0,3 М раствор сахарозы
4 5,0 5,0 среда культивирования

Среды фильтруют в стерильную посуду через бактериальные мембранные фильтры (диаметр пор – 0,22 мкм) и используют для приготовления сред для оттаивания и культивирования эмбрионов.

1.7. Извлечение эмбрионов.

1.7.1. Нехирургическое извлечение эмбрионов не требует специального операционного помещения. Его можно с успехом проводить непосредственно на ферме, с соблюдением правил асептики.

Обычно извлечение эмбрионов проводят на 7-8 день после осеменения донора (день охоты принимают за 0 день).

Перед извлечением эмбрионов проводят ректальное исследование донора для определения состояния половой системы и уровня реакции полиовуляции. При этом обращают внимание на величину, консистенцию яичников, подсчитывают количество желтых тел, неовулировавших фолликулов. Точно определить количество желтых тел при средней и хорошей реакции донора методом ректальной пальпации невозможно, поэтому уровень реакции устанавливают приблизительно. Желательно также при исследовании определить качество желтых тел по морфологическим признакам.

1.7.2. Подготовка инструментов.

Для извлечения эмбрионов необходимы следующие инструменты и растворы:

– катетер для извлечения эмбрионов в сборе;

– санитарный чехол;

– два пластиковых шприца на 50-60 см;

– шприц для воздуха (10-20 см3);

– два зажима для шлангов;

– шприц для инъекций на 10 см3 и на 5 см3 с иглами;

– емкость для сбора вымывной жидкости или фильтр для эмбрионов (ФЭ-1) в сборе с приемником;

– среда Дюльбекко для извлечения эмбрионов (400-1000 см );

– среда для санации маткн (100 см);

– 2% раствор новокаина для сакральной анестезии (5 см);

– фильтровальная бумага или бумажные салфетки;

– 70° этиловый спирт;

– одноразовые перчатки.

Вымытые и высушенные катетер и стилет орошают 70° этанолом снаружи и внутри, тщательно ополаскивают средой для извлечения эмбрионов и собирают, для чего стилет вводят в центральныйканал катетера и фиксируют его резьбовым замком. Катетер всобранном виде помещают в санитарный чехол и кладут на столик на стерильную салфетку.

Всеинструменты и среды, используемые для извлечения эмбрионов, должны быть стерильными.

1.7.3. Извлечение эмбрионов.

Корову-донорафиксируют в станке. Для снятия моторики кишечника и расслабления матки вводят эпидурально 5 см3 2% раствора новокаина.Хвост животного отводят в сторону и фиксируют в этом положении, чтобыон не мешал при работе. Прямую кишку очищают от фекальных масс, обмывают водой наружные половые органы, высушивают и тщательно протирают бумажной салфеткой.

Технологаккуратно вводит катетер во влагалище до упора в шейку матки и под ректальным контролем проводит катетер через шейку матки в тело, продвигает его в правый (или левый) рог до тех пор, пока не почувствует, что конец катетера упирается в изгиб рога. Ассистент освобождает резьбовой зажим стилета, и технолог, вытаскивая стилет, продвигает катетер дальше в рог матки. После того, как катетер введен глубоко в рог матки, ассистент окончательно вынимает стилет и накачивает в манжетку катетера 10-15 см3 воздуха.

Средудля извлечения эмбрионов вводят в рог матки отдельными порциями с помощью пластикового шприца емкостью 50-60 см3. Когда жидкость введена, технолог, легко массируя рог пальцами, всасывает жидкость обратно в шприц. Жидкость изшприца аккуратно сливают по стенке в стерильную емкость или эмбриональный фильтр. На промывание одного рога расходуется 200-500 см3 среды.

После промывания полости одного рога матки технолог вводит стилет в катетер, отодвигает катетер назад в тело матки, переводит его в другой рог и повторяет все манипуляции.

После извлечения последней порции жидкости из второго рога проводят санациюматки. Для этого, не выпуская из манжетки воздух, к катетеру присоединяют шприц с 40 см3 среды, содержащей антибиотики широкого спектра действия или сани­рующие препараты, используемые в средедля извлечения эмбрионов (ГАМП или полиген из расчета 300- 600 мкг на 1 см3 среды).

При правильно проведенном извлечении потери жидкости, как правило, не превышают 50 см3.

Катетер и стилет после работы тщательно промывают про­точной водой с нейтральныммоющим средством, ополаскивают дистиллированной водой, обрабатывают 70° спиртом и высушивают.

1.8. Поиск эмбрионов.

Используют два основных способа поиска эмбрионов:

1 способ. Вымывную жидкость отстаивают при комнатной температурене менее 30 минут, чтобы эмбрионы опустились на дно сосуда. Затем верхние слои жидкости аккуратно отсасывают с помощью сифона, оставляя в сосуде 60-100 см жидкости, и, осторожно перемешав, разливают в 2-3чашки Петри. Чашку Петри с жидкостью помешают на предметный столик стереомикроскопа. Поиск эмбрионов упорядочивается при использовании чашки Петри с разлинованным на полоски дном. Расстояние между соседними линиями составляет приблизительно 1 см.

2 способ. Вымывную жидкость фильтруют через эмбриональный фильтр ФЭ-1и поиск эмбрионов проводят непосредственно в фильтре.

Фокусировку микроскопа проводят по нижнему слою жидкости или по образовавшемуся осадку на дне чашки, так как именно в этом слое должны находиться извлеченные эмбрионы. Поиск проводят при 10 или 15-кратном увеличении стереомикроскопа, последовательно и тщательно просматривая каждую порцию жидкости. При этом передвигают чашку Петри или эмбриональный фильтр относительноокуляра стереомикроскопа слева направо или наоборот. Обнаруженные вполе зрения эмбрионы с помощью одноразового шприца (емкостью 1 см), соединенного с венозным катетером или пластиковым капилляром, переносят в маленькую чашку Петри со средой для культивирования. После просмотра всей площади дна чашки Петри или фильтра струёй жидкости с помощью шприца несколько раз перемешивают содержимое чашки, дают жидкости отстояться и просматривают еще раз.

1.9. Санитарная обработка эмбрионов.

Для устранения инфекционной контаминации перед пересадкой или замораживанием необходимо применять санитарную обработку эмбрионов. Для этих целей используют два способа:

1 способ. Эмбрионы проводят последовательно через ряд стерильных сред культивирования (5-10). Эмбрион микропипеткой переносят с минимальным количеством жидкости (около 0,01 см3) из одной стерильной чашки Петри в другую. При этом концентрация раствора уже в третьей чашке составляет 1/1000 исходной. Этот способ позволяет освободиться от возбудителей таких инфекционных заболеваний, как бруцеллез, лейкоз, инфекционная диарея, туберкулез, ящур, пустулезный вульвовагинит, хламидиоз и др.

От таких возбудителей заболеваний, как инфекционный ринотрахеит и везикулярный стоматит вышеописанным способом избавиться не удается, так как эти возбудители взаимодействуют с прозрачной оболочкой эмбриона и остаются на ней даже при многократных промываниях эмбриона.

2 способ. Обработке этим способом можно подвергать только эмбрионы с неповрежденной прозрачной оболочкой, предотвращающей проникновение фермента непосредственно к эмбриональным клеткам. Эмбрионы обмывают в 5 стерильных средах культивирования, затем 2-2,5 минуты в двух растворах трипсина с концентрацией 0,25%. После обработки трипсином эмбрионы вновь промывают в 5 стерильных средах культивирования. Этот способ позволяет избавиться от всех возможных возбудителей инфекционных заболеваний.

1.10. Оценка эмбрионов.

1.10.1. Характеристика состояния эмбрионов необходима для выявления среди них способных, к развитию и пригодных для пересадки реципиенту или криоконсервацид. При оценке учитывают стадию развития эмбриона, соответствие ее хронологическому возрасту, определяют морфологическое состояние эмбриона и, исходя из этих критериев, устанавливают его качество и пригодность для дальнейшего использования. Морфологическую оценку качества эмбрионов проводят под стереомикроскопом с увеличением в 60-80 раз.

Стадии развития эмбриона согласно международной классификации (IETS) представлены в таблице 13.4.

Таблица 13.4

Классификационный код Стадии развития
1 Не оплодотворенная яйцеклетка
2 2-12-клеточная стадия
3 Ранняя морула
4 Морула
5 Ранняя бластоциста
6 Бластоциста
7 Расширенная бластоциста
8 Вышедшая бластоциста
9 Вышедшая расширенная бластоциста

Приизвлечении возможно обнаружить эмбрионы, находящиеся только на 1-7 стадии развития.

Неоплодотворенная яйцеклетка (1) – имеет сферическую форму, окружена прозрачной, оболочкой, диаметр составляет 0,14-0,17 мм. Между прозрачной оболочкой и плазматической частью находится перивителлиновое пространство, заполненное жидкостью.

2-12-клеточная стадия (2) – имеет сферическую форму и от 2 до 12 клеток (бластомеров). Эмбрионимеет рыхлую структуру, между бластомерами нет прочных контактов.

Ранняя морула (3)клеточная масса до 32 бластомеров, занимает большую часть перивителлинового пространства, отдельные клетки (бластомеры) хорошо различимы. Перивителлиновое пространство четко выражено- Размер-0,14-0,17 мм.

Морула (4) клеточная масса состоит из 33-64 бластомеров, занимает 60-70% перивителлинового пространства, бластомеры образуют компактную массу. Перивителлиновое пространство выражено четко. Размер – 0,14-0,17 мм.

Ранняя бластописта (5)клеточная масса состоит из 65-130 бластомеров, занимает 70-80% перивителлинового пространства, в компактной массе бластомеров образуется небольшая наполненная жидкостью асимметрично расположенная полость (бластоцель). Эмбриобласт и трофобласт визуально еще плохо различимы. Перивителлиновое пространство выражено четко. Размер -0,14-0,17 мм.

Бластоциста(б) – клеточная масса состоит из 65-130 бластомеров, занимает большую часть перивителлинового пространства. Четко выражена дифференциация внешнего слоя трофобласта и более темной и компактной внутренней массы клеток (эмбриобласта). Бластоцель хорошо выражена, перивителлиновое пространство почти полностью вытеснено. Размер-0,14-0,20 мм.

Расширенная бластоциста (7) – состоит из 131-200 клеток, внешний диаметр увеличивается в 1,2-1,5 раза. Перивителлиновое пространство полностью исчезает. Прозрачная оболочка растянута и утончена до 1/3 первоначальной величины. Трофобласт в виде уплощенной цепочки располагается непосредственно под прозрачной оболочкой. Эмбриобласт – в виде компактного скопления клеток. Размер-0,18-0,22 мм.

1.10.2. Морфологические критерии оценки эмбриона.

Прозрачная оболочка. В норме – округлой формы, прозрачная. Трещины, сколы и любые изменения формы являются отклонениями от нормального состояния эмбриона и снижают оценку его качества.

Клеточный комплекс. Нормально развивающийся зародыш имеет равномерно окрашенную клеточную массу с округлыми, одинаковой величины или с разницей не более чем 1:2 бластомерами, отчетливо видны клеточные границы. На стадии бластоци-сты клетки трофобласта и эмбриобласта четко разграничены, бластоцель сформирована. В перивителлиновом пространстве отсутствуют включения и выделившиеся бластомеры. К отклонениям относят неравномерность окраски, размеров, формы и рых­лость клеточной массы, наличие гранул и вакуолей в бластомерах, наличие в периеителлиновом пространстве различных включений и бластомеров.

Оптимальное время для получения и пересадки эмбрионов -7-8 сутки после осеменения донора, когда большинство извлеченных эмбрионов находятся на стадиях морулы или бластоцисты. Неблагоприятные условия среды могут вызывать замедление или остановку развития.Поэтому при оценке необходимо обязательно учитывать соответствие стадии развития эмбриона его возрасту. Путем морфологического сравнения выявляют нор­мально развитые и отставшие в развитии на 24 и более часов эмбрионы (табл. 13.5).

Таблица 13.5

Соответствие возраста эмбриона стадии развития

День извлечения Стадия развития эмбриона (код IETS)
Нормальное развитие Задержка до 24 часов Задержка > 24 часов
7 4, 5, 6 3 <= 12 бластомеров
8 6, 7 4, 5 3, < 12 бластомеров

1.10.3. Классификация эмбрионов по качеству. На основании морфологии, стадииразвития и соответствия ее возрасту эмбрионы делятна категории:

– отличный или хороший (1) – эмбрион идеальный, сферический, симметричный, с клетками одного размера, цвета и плотности или имеет незначительныеизъяны, такие, какнесколько бластомеров, выделившихся из общей массы в перивителлиновое пространство, неправильная форма клеточной массы, несколько вакуолей, стадия соответствует возрасту;

– удовлетворительный (2) – морфологическое строение имеет серьезные замечания: присутствие разрушенных бластомеров, сильная вакуолизация, неоднородное окрашивание, низкая плотность клеточной массы, наличие множества клеток в перивителлиновом пространстве, отставание развития до 24 часов;

– плохой (3) – многочисленные вытесненные из общей массы бластомеры, нарушение межклеточных связей, дегенерированные клетки, клетки различного размера, много крупных вакуолей и гранул, отставание развития более 24 часов, частично разрушенная или деформированная зона пеллюцида.

– мертвый, и/или дегенерировавший (4) – сильные разрушения клеточной массы, связь между бластомерами нарушена, бластомеры разных размеров, несоответствие хронологическому возрасту, сильная вакуолизация и грануляция, разрушена зона пеллюцида.

1.11. Пересадка эмбрионов.

1.11.1. Отбор реципиентов и подготовка к эмбриопересадкам.

Пересадки эмбрионовпроводят в хозяйствах, благополучных по инфекционным заболеваниям, с хорошей организацией производства, обеспечивающей сбалансированное кормление и оптимальный уровень воспроизводства стада.

Для пересадок используют как коров, так и телок. Коров в качестве реципиентов используют не ранее, чем через 50-60 дней после не осложненного отела, не старше 7 лет, клинически здоровых, с регулярными половыми циклами нормальной продолжительности. Телки должны быть случного возраста, не старше 22 месяцев, средней упитанности, с живой массой, соответствующей стандарту породы, ни разу не осеменявшиеся. При отборе реципиентов проводят тщательное ректогенитальное обследование с целью исключения особей с неразвитыми половыми органами или наличием патологии.

Реципиентов отбирают после спонтанной охоты или син­хронизации охоты простагландинами.Ярко выраженная охота при наличии всех признаков и стадий является непременным условием пригодности животного к пересадке эмбрионов. Разница в синхронности полового цикла коровы-донора и реципиента не должна превышать 24 часов.

В день пересадки эмбрионов проводят ректальное исследование состояния половых путей и яичников реципиентов. Матка и шейка матки должны быть в норме по размерам, консистенции, подвижности. Любые отклонения (огрубление стенок матки, отечность, увеличение размеров и др.) являются противопоказанием для эмбриопересадки. При исследованиияичников оценивают состояние желтого тела по размеру, форме и консистенции, а также соответствию его развития стадии полового цикла. Хорошего качества желтое тело должно иметь основание не менее 1,5 см в диаметре и ясно выраженную головку. При задержке развития желтого тела, отсутствии его, а также при наличии фолликула, кисты или другой патологии яичника пересадку эмбриона реципиенту не проводят.

После пересадки эмбриона реципиента оставляют на привязи в течение суток. Кормление и содержание реципиентов осуществляют в обычных условиях, как для стельных животных, не допуская травмирования и стрессовых ситуаций.

В группах реципиентов ведут постоянное наблюдение за возможным проявлением повторной охоты. На 60-90 дни после пересадки животных-реципиентов ректально исследуют на наличие стельности.

1.11.2. Оттаивание эмбрионов и подготовка к пересадке.

Пайету с эмбрионом быстро извлекают из сосуда Дьгоара, выдерживают на воздухе 15 секунд, затем горизонтально погружают в водяную баню (24…28°С) на 10-15 секунд (до полного оттаивания содержимого пайеты). 11осле оттаивания насухо протирают поверхность пайеты фильтровальной бумагой и, обрезав кончик ее со стороны, противоположнойпробке, вставляют этот конец в микроаспиратор или пластиковый пшриц (1 см3). Затем обрезают другой, свободный конец пайеты. Под микроскопом контролируют выход эмбриона из пайеты в стерильную чашку Петри. Обнаруженный эмбрион переносят в маленькую чашку Петри с раствором для удаления криопротектора.

Применяют два метода удаления криопротектора.

1 метод (трехступенчатый)

1 ступень: 6,6% глицерин + 10,3% (0,ЗМ) сахароза- 5 минут;

2 ступень: 3,3% глицерин + 10,3% (0,ЗМ) сахароза – 5 минут;

3 ступень: 10,3% (0,ЗМ) сахароза – 10 минут. Затем эмбрионы промывают в трех порциях среды культивирования.

2 метод (одноступенчатый)

34,2% (1,ОМ) сахароза – 8 минут.

Затем эмбрионы промывают в среде культивирования.

Процесс удаления криопротектора проводят под микроскопом во избежание потери эмбриона.

После удаления криопротектора оценивают эмбрион по качеству и помещаютего в пайету для пересадки. Время от оттаивания эмбрионадо его пересадки не должно превышать 50 минут.

1.11.3. Заправка эмбрионов в пайеты для пересадок.

Эмбрионы заправляют в 0,25 см3 пайеты. Заправку осуществляют с помощью пластикового шприца (1 см ) или микроаспиратора по следующей схеме (рис. 2): столбик среды культивирования (1 см), столбик воздуха (1 см), столбик среды культивирования (1 см), столбик воздуха (1 см), среда с эмбрионом, столбик воздуха (1 см), столбик среды культивирования (1 см), столбик воздуха (1 см), столбик среды культивирования (1 см). Перенос эмбриона из среды культивирования в пайету производят под небольшим увеличением микроскопа.

Французские пайеты перед заправкой укорачивают, для чего пыж продвигают на 7-8 мм вглубь пайеты и аккуратно острыми ножницами отрезают 4-5мм кончика пайеты со стороны пыжа. Отечественные пайеты закупоривают стеклянным шариком.

После заправки пайеты маркируют. Для этого с помощью фломастера на кончик пайеты со стороны пыжа вдоль ее оси наносят точки и длинные черточки.Одна точка – единица, две – двойка, три – тройка, четыре – четверка, длинная черточка (6-8 мм) – пятерка, длинная черточка и точка – шестерка и т.д. Если пайет больше десяти, то лучше каждый десяток маркировать фломастерами разного цвета.

1.11.4. Подготовка инструмента к пересадкам.

Пересадка эмбрионов осуществляется с помощью катетера для пересадок, снабженногостерильным одноразовым чехлом. Катетер хранится в цилиндрическомпластиковом футляре, предохраняющем его от загрязнения и механических повреждений.

Непосредственно перед пересадкой пайету с эмбрионом заправляют в катетер, надевают на катетер стерильный одноразовый чехол и фиксируют его стопорной шайбой или замком. Заправленный катетер помещают в санитарный чехол.

1.11.5. Пересадка эмбрионов.

Животных-реципиентов фиксируют в станке, делают сакральную анестезию 2% раствором новокаина или вводят препарат, расслабляющий маточную мускулатуру (например, “Хане-гиф”). Технолог по пересадкам очищает прямую кишку от фекальных масс, тщательно вытирает сухой бумажной салфеткой наружные половые органы животного, при необходимости их обмывают теплой водой и насухо вытирают. Технолог вводит катетер во влагалище и под ректальным контролем проводит его через шейку в тело матки, направляя в рог, ипсилатеральный яичнику с желтым телом. Убедившись, что катетер введенна достаточную глубину (в верхнюю треть рога), технолог, плавно надавливая на поршень катетера, выталкивает жидкость с эмбрионом в полость рога матки и осторожно извлекает катетер из матки.

1.12. Подготовка эмбрионов к замораживанию.

1.12.1.Эмбрионы, пригодные для замораживания (отличного, хорошего и удовлетворительного качества), эквилибрируют в криозащитной среде с глицерином (см. п. 1.6.3.).

Применяют одноступенчатое и многоступенчатое насыщение эмбрионов криопротектором. При отличном качестве эмбрионов используют одноступенчатый метод. При наличии повреждений у эмбрионов предпочтительнее использовать многоступенчатый метод, как более щадящий.

Для приготовления криозащитных сред используют среду культивирования (фосфатно-солевой буфер Дюльбекко с 15% фетальной сыворотки крови крупного рогатого скота или 0,4% бычьего сывороточного альбумина) с добавлением необходимого количества глицерина. Готовят ряд растворов с постепенно увеличивающейся концентрацией глицерина и выдерживают эмбрион в каждом растворе определенноевремя. Последний раствор содержит 1,5М глицерина. Он являетсякриозащитной средой, в которой замораживают эмбрионы.

1.12.2. Двухступенчатое насыщение. Отобранные для замораживания эмбрионы переносят из среды культивирования в 0,75М раствор глицерина, а затем помещают в 1,5М раствор, выдерживая в каждом по 10 минут. Эти операции проводят подмикроскопом.

1.12.3. Одноступенчатое насыщение.

Эмбрионы отличного качества из среды культивирования помещают сразу в 1,5М раствор глицерина и выдерживают в нем 10 минут.

Длязамораживания эмбрионов используют французские или отечественныенайеты емкостью 0,25см.

Заполняют пайеты так же, как, и для пересадки эмбрионов (см. п. 1.11.3.). После заправки пайеты запаивают. Маркировка пайет может осуществлятьсяразличными способами:

– в пайету со стороны пыжа вставляют цветную пластмассовую пробку, на которойтонким маркером записывают дату извлечения, номер пайеты,номер и кличку донора, код пункта трансплантации, номер и кличку быка;

– на пайете тонким маркером записывают дату извлечения, номер пайеты, номер и кличку донора, код пункта трансплантации, номер и кличку быка;

– пайету вставляют в специальный прозрачный пластиковый контейнер и закупоривают металлической пластинкой с выбитым на ней кодовым пятизначным номером,который заносят в специальный регистрационный журнал, где дана его расшифровка, а именно: дата извлечения, кличка донора, стадия развития и опенка качества, а также способ замораживания. В дальнейшем в журнал вносят информацию об использовании эмбриона.

Заполнение, закупоривание и маркировку пайет необходимо закончить за 10 минут, в течение которых эмбрион эквилибрируется в среде с 1,5М глицерином. Временной интервал от помещения эмбриона в среду с криопротектором до началаохлажденияне должен превышать 30-40 минут.

1.13. Замораживание эмбрионов.

1.13.1. Замораживание эмбрионов в замораживателе ЗЭМ Харьковского СКТБ с ОП ИПКнК.

Замораживатель ЗЭМ (замораживатель эмбрионов мобильный) состоит из регулирующего блока и камеры. С помощью регулирующего блока можно задать однуиз двух программ автома­тического охлаждения камеры.

Программа 1

– стабилизация температуры 20°С±2°С;

– охлаждение со скоростью 1 град/мин от 20°С до -7°С;

– стабилизация температуры -7°С (1-2 минуты);

– охлаждение со скоростью 0,3 град/мин от -7°С до -32°С;

– стабилизация температуры -32°С (30 минут).

Программа 2

– стабилизация температуры 20°С+2°С;

– охлаждение со скоростью 1 град/мин от 20°С до 0°С;

– стабилизация температуры 0°С (1-2 минуты);

– охлаждение со скоростью 0,3 град/мин от 0°С до -32°С;

– стабилизация температуры -32°С (30 минут). Перед работой цилиндрическую камеру погружают в сосуд Дьюара Х-34Б или СДС-5. Охлаждение осуществляется автоматически по одной из выбранных программ.

Подготовку замораживателя к работе проводят по прилагаемой к нему инструкции. После заполнения и закупорки пайет их помещают в рабочую камеру замораживателя маркировкой вверх и включают программу охлаждения. По окончании программы замораживания пайеты извлекают из рабочей камеры и быстро переносят в сосуд Дьюара с жидким азотом на хранение. Полный цикл замораживания эмбрионовв ЗЭМе занимает около двух часов.

1.13.3. Замораживание эмбрионов в программируемом замораживателе ЭМБИ-К.

Замораживатель ЭМБИ-К состоит из камеры и электронного регулирующего блока. Камеру устанавливают на сосуд Дьюара СДС-5. На сдан цикл замораживания расходуется 200-250 г жидкого азота. Температура в камере устанавливается и поддерживается с помощью электронного блока, который управляет работой электромагнитного клапана, регулирующего подачу жидкого азота. Охлаждение эмбрионов происходит в камере, заполненной 96° этиловым спиртом.

Электронный регулирующий блок позволяет задавать различные режимы охлаждения в следующих пределах:

– устанавливаемая температура кристаллизации от 0 до -10°С (в зависимостиот состава криозащитной среды);

– устанавливаемая предельная температура охлаждения —20…40°С;

– устанавливаемая скорость снижения температуры с колебаниями, не превышающими 0,2 град/мин в интервалах: 0-0,55 град/мин; 0,55-1,2 град/мин; 1,2-3,0 град/мин.

Подготовку замораживателя к работе и замораживание эмбрионов проводят согласно инструкции. Пайеты в обязательном порядке запаивают (во избежание проникновения спирта внутрь пайеты) и для маркировки наносят надписи на пластмассовые пробки, вставленные в пайеты.

В процессе охлаждения температуру спирта в камере контролируют с помощью ртутного (марки ТЛ-4 ГОСТ 215-73) или толуолового (марки ТЛ-15 ТУ 25-11-964-74) термометров.

Полный цикл замораживания в устройстве ЭМБИ-К продолжается, в зависимости от выбранного режима охлаждения, от 35 минут до 1,5 часов.

1.14. Низкотемпературное хранение эмбрионов.

Пайеты с эмбрионами до использования хранят в сосудах Дьюара, заполненныхжидким азотом.

Пайеты для хранения помещают в специальные контейнеры. Кодовый номер наносят на алюминиевую пластинку.

Контейнер представляет собой прозрачную полипропиленовую трубку с наружным диаметром 4 мм, внутренним – 3,5 мм и длиной 180мм. Один конец контейнера сужен до 1,5 мм. В качествемаркировочного элемента используют алюминиевую пластинкуразмером 32х4х1мм. На нее нанесен кодовый номер в виде колонки цифр, букв и их комбинаций. Размер пластинки позволяет нанести 5-6 легкочитаемых знаков. Таким образом, можно промаркировать десятки тысяч пайет с эмбрионами.

Контейнер с пайетойразмещают в канистре сосуда Дьюара. Канистра разделена на 6 пронумерованных секций, в каждой из которых помещают 5-6 контейнеров. Канистра делится на секции дюралюминиевой шайбой с пружинящими лепестками, надежно удерживающими ее в верхнейчасти канистры.

После окончания процесса замораживания пайеты с эмбрионами из камеры замораживателя переносят в теплоизолированную емкость, заполненную жидким азотом. Туда же помещают для предварительного охлаждения необходимое количество контейнеров.

У пайеты с эмбрионом удаляют промежуточную маркировочную пробку и быстро (2-3 секунды) переносят ее внутрь охлажденного контейнера, стараясь как можно меньше держать пайету вне жидкого азота. Промаркированные контейнеры быстро перекладывают в сосуд Дьюара, размещая их в канистрах.

Информацию о размещении контейнеров в канистрах, а также о самой пайете заносят в регистрационный журнал или при наличии компьютера в базу данных. В дальнейшем по имеющемуся на контейнере кодовому номеру можно получить всю информацию о его размещении и содержимом.

Необходимо систематически проверять уровень азота. Он не должен снижаться более, чем на половину объема сосуда.

2. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ ЛОШАДЕЙ

2.1. Отбор кобыл в доноры и реципиенты.

В описанной методике извлечение эмбрионов у кобыл-доноров проводят в спонтанную или стимулированную охоту без индуцирования реакции полиовуляции.

2.1.1. В качестве доноров эмбрионов используют нормальных здоровых плодовитыхкобыл высокой и выдающейся племенной ценности по рекомендациям специалистов-селекционеров.

2.1.2. Оптимальный возраст кобылы-донора составляет 3-14 лет.

2.1.3. Кобылы-реципиенты должны быть клинически здоровы, с нормальной физиологией половой системы, без патологии половых путей, должны иметь развитое нормально функционирующее вымя. Реципиенты должны иметь крепкую конституцию иживую массу, соответствующую стандарту породы.

В качестве реципиентов используют наименее ценных и беспородных животных.

2.1.4. В период выбора животных для трансплантации (как доноров,так и реципиентов) с целью проверки состояния половой системы ранее холостивших, либо имевших патологические роды кобыл, их следует случить в одном-двух половых циклах с нормальным плодовитым жеребцом и через 8-9 дней после овуляции попытаться извлечь у них эмбрионы- При наличии в промывной жидкости жизнеспособного зародыша кобыла считается здоровой и отбирается для работы. При отрицательном результате в двух попытках предварительно намеченную кобылу выбраковывают.

В период подбора животных они должны быть подвергнуты всем необходимым ветеринарным обработкам и исследованиям, предусмотренным ветеринарными правилами.

2.2. Синхронизация половых циклов кобыл-доноров и кобыл-реципиентов.

2.2.1. Для успешного проведения трансплантации эмбрионов рекомендуется готовить на одну кобылу-донора 2-3 кобылы-реципиента.

2.2.2. Работу по предварительной синхронизации половых циклов начинают за один цикл до извлечения эмбриона и проводят по следующим схемам.

Схема 1. Если овуляция у кобылы-донора за цикл до пересадки наступила одновременноили чуть раньше (до трех суток), чем у потенциального реципиента, то в момент установления овуляции у донора в подготавливаемом цикле кобыле-реципиенту следует ввести внутривенно 2000 МЕ хорионического гонадотропина. Овуляция у реципиента должна наступить через 36-48 часов после инъекции. Асинхронность циклов донора и реципиента при этом составит 48 часов.

Схема 2. Бели овуляция наступила у кобылы-донора раньше, чем у реципиента на 3-10 суток, то в первый день проявления охоты у донора, кобыле-реципиенту следует ввести внутримышечно препарат простагландина Р-2а. Затем в день наступления овуляции у кобылы-донора кобыле-реципиенту вводят внутривенно 2000 МЕ хорионйческого гонадотропина.

Схема 3. Если за цикл до пересадки овуляция у кобылы-реципиента наступила раньше,чем у кобылы-донора на 2-6 дней, то через 6 дней после овуляции у кобылы-донора обеим кобылам (и донору, и реципиенту) вводят внутримышечно препарат простагландяна Р-2а и через 5 суток – внутривенно 2000 МЕ хорио-нического гонадотропина.

2.2.3. Охоту у кобыл-доноров и реципиентов определяют жеребцом-пробником ежедневно. При выявлений охоты ежедневно проводят двукратные ректальные исследования состояния яичников.

2.2.4. При наличии в яичнике кобылы-донора фолликула третьей стадии ее осеменяют или случают с намеченным по подбору жеребцом-производителем. Интервал между повторными случками либо осеменениями свежей спермой составляет 24 часа, при осеменении криоконсервированной спермой – 12 часов. Осеменение кобылы-донора прекращают после овуляции.

2.2.5. Одновременно с осеменением кобылы-донора проводят синхронизация полового цикла кобыл-реципиентов. Степень синхронности половых функций кобылы-донора и кобылы-реципиента находится в пределах от 24 до 72 часов.

2.3. Извлечение эмбрионов у кобыл-доноров.

2.3.1. Извлечение и пересадку зародышей проводят через 8-8,5 суток после овуляции у кобылы-донора.

Перед началом работы готовят необходимые растворы и обрабатывают инструмент. Катетер для извлечения эмбрионов двукратно стерилизуют кипячением в течение 40 минут в металлическом стерилизаторе, затем воду сливают и, не открывая крышки, охлаждают катетер в стерилизаторе до комнатной температуры. Колбы, воронки и другую стеклянную посуду заворачивают в пергамент и прокаливают в течение трех часов в сушильном шкафу при температуре 140°С и затем охлаждают. Полиэтиленовые чехлы в перчатки одноразового пользования обеззараживают под бактерицидными лампами в течение 12 часов.

2.3.2. Кобылу-донора фиксируют в фиксационном станке освобождают прямую кишку от фекальных масс и проводят туалет наружных половых органов и прилежащих к ним наружных покровов. Хвост бинтуют, либо помещают в специальный полиэтиленовый чехол одноразового пользования.

2.3.3. Оператор рукой в одноразовой полиэтиленовой перчатке вынимает катетер из стерилизатора, ополаскивает его приготовленной промывной жидкостью и надевает защитный полиэтиленовый чехол на головную часть катетера ируку. Вводит руку с катетером во влагалище кобылы, разъединяет чехол и вводит инструмент через цервикальный канал в тело матки пока передняя часть катетера с фиксирующим баллоном не войдет в матку. После этого помощник оператора шприцем через специальный канал вводит в фиксирующий баллон катетера 60 см3 воздуха и зажимает воздушную трубку специальнымзажимом.

После того, как катетер зафиксирован в теле матки, второй помощник заливает через воронку в катетер промывную жидкость. Затем катетер перекрывают, снимают воронку и опускают наружный конец инструмента в колбу с промывной жидкостью. Дальнейшее вливание раствора в матку и его извлечение проводят путем поднятия и опускания колбы на 1-1,5 метра выше и ниже уровня половых органов кобылы. Промывание матки происходит по принципу сифона. После трехкратного промывания матки промывным раствором двукратно промывают матку ополаскивающим раствором (см. п. 2.6), Колбы с использованными растворами переносят для поиска и оценки эмбрионов. Выпускают воздух из фиксирующего баллона и извлекают катетер из матки. Кобылу-донора освобождают и выводят из фиксационного станка.

2.4. Поиск, оценка и заправка эмбрионов для пересадки.

2.4.1. Эмбрионы лошадей в возрасте 8-8,5 дней имеют достаточно крупные размеры (от 0,7 до 1,4 мм в диаметре) и хорошо видны в промывной жидкости невооруженным глазом, имеют шаровидную форму и полупрозрачны.Осмотр колб начинают с ополаскивающего раствора, а затем – промывной жидкости. Обнаруженные эмбрионы переносят в чашки Петри со средой ФБС для их оценки под стереомикроекопом.

2.4.2. Эмбрионы делят на категории;

– жизнеспособные эмбрионы имеют правильную форму (шаровидную или слегка эллипсоидную), полупрозрачны, имеют четко выраженную клеточную структуру. Эмбриональная оболочка (бластолемма) плотно прилегает к клеточной массе и при осмотре не видна;

– проблемные или сомнительные эмбрионы также полупрозрачны, шаровидной формы, имеют четкую клеточную структуру. Бластолемма частично или полностью отслоена от клеток трофобласта и хорошо видна при осмотре зародыша под микроскопом;

– погибшие эмбрионы непрозрачны, матового цвета, бластолемма отделена от клеточной массы, клетки сморщены и сжаты в бесформенный комок. Пересадку таких эмбрионов не проводят.

2.4.3. После оценки предназначенный для пересадки эмбрион стерильной пипеткой, переносят из раствора ФБС в чашку Петри (0=35-40 мм) с пересадочным раствором- Эмбрион заправляют в пайету по следующей схеме: 1/3-1/4 длины пайеты пересадочный раствор, 5-7 мм пузырек воздуха, 1/3-1/4 пайеты раствор с эмбрионом, снова пузырек воздуха и оставшееся пространство заполняют пересадочным раствором. Свободный конец пайеты закупоривают стеклянным шариком.

2.4.4. Пайету помещают в катетер для пересадки, навинчивают наружный чехол инструмента, в катетер вставляют стилет на 2/3 длины, надевают полиэтиленовый санитарныйчехол. Готовый к пересадке катетер должен находиться в горизонтальном положении.

2.5. Пересадка эмбрионов.

2.5.1. Перед пересадкой эмбриона кобыле-реципиенту вводят внутримышечно 8-10 см3 миорелаксанта (“Ханегиф”), Через 15 минут после инъекции кобылу-реципиента фиксируют в станке, освобождают от фекальных масс прямую кишку, тщательно с мылом моют наружные половые органы и прилегающую к ним область, бинтуют и фиксируют хвост в верхнем положении.

2.5.2. Оператор рукой в одноразовой полиэтиленовой перчатке берет приготовленный для пересадки катетер с эмбрионом, надевает сверху на головную часть катетера и руку защитный полиэтиленовый чехол и, введя руку.с инструментом во влагалище кобылы, разъединяет защитный чехол и вводит инструмент в цервикальный канал. Нажав на наружный конец, прокалывает катетером второй защитный санитарный чехол.

2.5.3. Введя катетер в тело матки кобылы-реципиента на глубину 2-5 см, разворачивает инструмент прорезью шайбы и выходным отверстием вниз и выталкивает содержимое пайеты в матку, вдвинув полностью стилет в катетер. Инструмент извлекают из влагалища вместе с рукой, освобождают и выводят кобылу из станка.. .После пересадки кобылу-реципиента водят 5-7 минут.

2.5.4. Приживляемость. эмбрионов у кобыл-реципиентов учитывается по результатам ректального исследования на 40-45 день после трансплантации.

2.6. Приготовление растворов.

Дляизвлечения, хранения и пересадки эмбрионов лошадей применяют следующие растворы:

  1. Промывной раствор применяют для извлечения и непродолжительного хранения (до 1 часа) эмбрионов.На промывание одной кобылы-донора расходуют 2-2,5 л раствора. Для этого берут среду Дюльбекко и добавляют санирующий препарат согласно наставлению по применению. Раствор перед употреблением подогревают до температуры 36…37°С.
  2. Ополаскивающий раствор используют для санации матки кобылы-донора после извлечения эмбриона. Для его приготовления в стерильный физраствор вводят санирующие препараты широкого спектра действия (ГАМП и полигон из расчета 300 или 600 мкг/см3).
  3. Пересадочный раствор предназначен для пересадки эмбрионов и кратковременного их культивирования при 37°С. Для этого в 4 см промывного раствора вводят 4 см желтка куриного яйца. После перемешивания раствор готов к употреблению.

3. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ ОВЕЦ И КОЗ

3.1. Отбор маток в доноры эмбрионов.

3.1.1. В доноры эмбрионов отбирают животных с рекордной продуктивностью, проверенныхпо качеству потомства, разведение которых планируется в селекционных программах. Оптимальным для донора является возраст 3-4 года.

3.1.2. В качестве доноров используют маток без послеродовых осложнений и нарушений воспроизводительных органов. Обязательным условием является наличие нормального полового цикла и заводской упитанности. За 1,5-2 месяца до начала обработки на полиовуляцию проводят отбивку молодняка от маток.

3.1.3. Нормы кормления в это время, а также в период получения эмбрионов увеличивают на 0,2-0,3 к.е. или на 2,5-3,5 МДж по сравнению с нормами кормления маток первой половины суягноста или сукозности.

В летний период доноров пасут на высокоурожайных пастбищах. При снижении качества пастбищ обязательно подкармливать маток концентрированными кормами в объеме 0,2-0,4 и- и силосом – по 1,2-2 кг на голову в сутки.

При использовании овец и коз в качестве доноров в зимний период их рацион должен состоять из высококачественных сена, силоса и концентратов. Рацион должен быть сбалансирован по минеральным веществам и витаминам.

3.2. Обработка животных для вызывания полиовуляции.

3.2.1. Для полиовуляции целесообразно отбирать овей и коз в спонтанную охоту. Охоту выявляют с помощью пробника. Для вызывания полиовуляции применяют сывороточные (ГСЖК) или гипофизарные (ФСГ) гонадотропины. Сроки обработок маток на полиовуляциго представлены в таблице 13.6.

Таблица 13.6

Режимы обработок овец и коз на полиовуляцию

Препараты Дозы Способ введения Дни цикла Число инъекций
овцы козы
ГСЖК 1000-2000 ИЕ внутримышечно 11-12 14-18 однократно
ФСГ 18-24 мг внутримышечно с 11 по 14 с 13 по 16 дважды в день

3.2.2. Для вызывания полиовуляции ФСГ вводят животным в убывающих дозах. Для стимуляции охоты вводят простагландины через 1-2 дня после начала обработок гонадотропинами. Энзапрост вводят овцам в дозе 8-15 мг, козам – 4-10 мг; клопростенол или его аналоги (эстрофан, анипрост) вводят овцам в дозе 150-250 мкг, козам – 100-250мкг. Примерная схема обработок представлена в таблице 13.7.

Таблица 13.7

Примерная схема обработок овец и коз на полиовуляцню

Дни обработок Время обработок в течение суток, час 1-я схема 2-я схема
ФСГ, мг ПГF-2, мкг ФСГ, мг ПГF-2, мкг
1 8 4 1500
20 4
2 8 3
20 3
3 8 2 250 250
20 2
4 8 2
20 2
5 вечер выявление охоты и осеменение выявление охоты и осеменение
6 утро осеменение осеменение
12 извлечение эмбрионов

В зимний период для повышения оплодотворяемости ооцитов и выживаемости эмбрионов кадедые десять дней проводят обработку доноров препаратами витаминов А и Е в дозах 7500 ИЕ и 50 мг, соответственно.

3.2.3. Охоту у овец и коз определяют с помощью пробников. Осеменение доноров проводят сразу послевыявления охоты и повторяют через 8 часов. При продолжении охоты на следующий день осеменение повторяют.

Более высокие результаты по оплодотворяемости у овец и коз получают при введении семени с помощью лалароскопа через голодную ямку в маточный рогна несколько сантиметров выше истмуса. Операцию проводят под местной анестезией. Осеменение доноров лапароскопическим методом является гарантией высокой оплодотворяемости ооцитов у овец. У коз этот способ осеменения еще более эффективен.

3.3. Извлечение эмбрионов.

3.3.1. Извлечение эмбрионов у овец и коз можно проводить на 3-4 день цикла (раннее извлечение) или на 5-7 день.

На 3-4 день эмбрионы овец и коз извлекают из яйцеводов на 8-16-клеточной стадии развития. Раннее извлечение повышает количество жизнеспособных эмбрионов при возможном рассасывании желтых тел на 4-6 дни цикла. При извлечении эмбрионов на 5-7 день цикла они находятся в матке на стадиях морул или бластоцист.

Извлечение эмбрионов у овец и коз проводят хирургическим методом. Перед извлечением маток выдерживают на голодной диете в течение 12 часов. Извлечение эмбрионов осуществляют под общей или местной анестезией. Для анестезии применяют полинаркон-5, комбелен, рампунь, новокаин.

Животное фиксируют на операционном столе в дорсальном положении, на оперируемом участке удаляют шерстный покров, проводят асептическую обработку операционного поля и накладывают стерильную салфетку. По белой линии живота, как можно ближе к вымени, делают разрез длиной 5-6 см. Осторожно извлекают рога матки с яичниками и располагают их на салфетке. При визуальном осмотре на яичниках подсчитывают число желтых тел и определяют стадию их развития, а затем приступают к извлечению эмбрионов.

При извлечении на 3-4 день цикла в яйцевод вводят тонкий катетер и закрепляют его при помощи зажима или лигатуры. Через прокол стенки матки на расстоянии 1 см от бифуркации вводят катетер Фоллея (с наружным диаметром 2 мм), надувают воздухом баллончик, фиксируя катетер в роге матки. В качестве среды для извлечения применяется фосфатно-солевой буфер (среда Дюльбекко) с добавлением 2% фатальной сыворотки. Сначала промывают яйцевод, вводя через катетер 3-6 см среды. Затем промывают матку, вводя среду Дюльбекко (10-25 см3) через иглу, вставленную в верхушку рога. На промывание одного рога матки используют 100-140 см среды. Промывную жидкость, извлеченную из матки через катетер Фоллея, переносят в фильтр для эмбрионов. Аналогично промывают второй рог матки донора. При извлечении эмбрионов на 5-7 день ограничиваются только промыванием матки.

3.3.2. Оценку, криоконсервирование и хранение эмбрионов проводят по методикам, применяемым при работе с эмбрионами крупного рогатого скота.

3.3.3. После операции извлечения эмбрионов матку и яичники животного обмывают гепаринизированным физраствором или высокомолекулярным декстрином для профилактики образования спаек, на операционную рану накладывают швы и вводят в брюшную полость антибиотики. Оперированных животных в течение 5-6 дней содержат в отдельных станках под постоянным наблюдением.

Овец и коз в качестве доноров используют не более 3 раз в один сезон, после чего их осеменяют для получения потомства.

3.4. Пересадка эмбрионов.

3.4.1. При пересадке, необходимо соблюдать синхронность стадии цикла реципиента и стадии развития эмбриона. В отличие от эмбрионов овец эмбрионы коз менее чувствительны к асинхронности охоты (до 24 часов) между донором и реципиентом.

На практике синхронизация охоты донора и реципиента достигается либо путем выбораживотных с соответствующими циклами, если работа ведется в крупных отарах, либо синхронизацией охоты, если количество реципиентов ограничено. Синхронизацию охоты проводят однократными или двукратными обработками простагландинами согласно наставлению по их применению.

3.4.2. Пересадку проводят хирургическим методом через разрез по белой линии живота или в области голодной ямки. Ранние эмбрионы (до 16 бластомеров) пересаживают непосредственно в яйцеводы. Эмбрионы вводят стеклянной или пластиковой пипеткой через бахромку в яйцевод на глубину 3-4 см. Эмбрионы на более поздней стадии развития пересаживают в полость рога матки на расстоянии 2-3 см от истмуса. Тупой иглой (пипеткой) делают прокол стенки матки и помещают эмбрион на расстоянии 2-5 см от места прокола.


0

Автор публикации

не в сети 10 часов

Никита Григорьевич

7 600
На кого ориентирован сайт? ответ однозначный -на нормальных людей))которые заниматься ветеринарией, фермерством, кто у себя держит коровку.
Комментарии: 872Публикации: 3013Регистрация: 16-10-2014
Нравиться 112330